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　　北京时间10月2日，备受瞩目的“2023年诺贝尔生理学或医学奖”被授予科学家Drew Weissman和Katalin Karikó，以表彰他们在mRNA疫苗领域的杰出贡献。
 

　　在新冠爆发之前，mRNA疫苗对大多数人来说还是一个相对陌生的概念。这种疫苗是通过编码病原体某个蛋白组分的基因序列的mRNA，在体内表达成蛋白质进行抗原呈递，并具有自佐剂作用。相比其他疫苗，mRNA疫苗具有“即插即用”的优势，只需知道病原体结构蛋白的基因序列就可以进行大规模生产。此外，它还能在体内引发强烈的免疫应答，并产生高滴度的抗体，因此被选为疫苗之选。接下来，让我们一起看看两位诺奖得主在2018年发表的一篇文章^[1]，以更好的理解mRNA疫苗到底有多牛！
 

 

　　这篇文章对mRNA疫苗的研究非常全面:
 

　　1、涉及了流感疫苗、HIV疫苗和寨卡疫苗
 

　　2、包含小鼠和灵长类动物实验
 

　　3、从体液应答和细胞免疫应答等方面对疫苗进行评估
 

　　m1Ψ-mRNA-LNP 可长时间有效地生产蛋白质
 

　　1-甲基假尿苷(m1Ψ)修饰mRNA，可以防止mRNA疫苗在体内产生炎症反应，同时还能提高蛋白质的表达效率。这是两位诺贝尔奖获得者对mRNA疫苗做出的重要改进之一。接下来，我们来看一下这种改进带来的实验结果：
 

　　图1. 相对与未修饰的mRNA-LNP，编码荧光素酶(Luc)的m1Ψ-mRNA-LNP的翻译水平较高，并可以维持13天的蛋白质表达
 

　　小鼠细胞免疫评估
 

　　图2. 相比于对照mRNA、灭活流感病毒疫苗以及未修饰mRNA疫苗，m1Ψ修饰的HA mRNA疫苗(编码流感病毒HA蛋白)能产生更强的抗原特异性CD4+细胞免疫应答
 

　　对于CD8+细胞免疫应答结果也类似。HA mRNA疫苗免疫后，总脾GC(生发中心)B细胞大幅增加(约8-59倍)，单次免疫后8天脾浆细胞的数量也增加，并显著增加了脾脏中Tfh细胞(滤泡辅助性T细胞)总数
 

　　小鼠抗体评估
 

　　流感疫苗诱导的抗体滴度主要通过血凝抑制(HAI)测定法来测量。在这种方法种，1:40的体外HAI滴度被认为可以保护人类免受流感感染。在接种HA mRNA疫苗单次免疫后，在2周观察到640的HAI滴度，在4周时这个数值增加到2000。
 

　　图3. 在体液免疫应答方面，mRNA疫苗所产生的抗体滴度是最高的，并且能持续至少一年不降低
 

　　在灵长类动物实验中，编码寨卡病毒prM-E蛋白的mRNA疫苗，也产生了持续一年的高滴度抗体。
 

　　抗体亲和力测定
 

　　由于Tfh细胞促进亲和力成熟，小鼠单次免疫HA mRNA疫苗后多克隆抗体的亲和力是重要表征模型。而高滴度不一定意味着高亲和力，所以在这篇文章中，作者使用赛多利斯Octet® 非标记分子互作系统来检测血清中多克隆抗体的亲和力！首先使用AMC传感器(anti-mouse IgG)固化血清中的抗体，与31.25nM的HA进行结合解离，并用pH2.5的甘氨酸进行再生，然后用1:1模型拟合获得KD值(平衡解离常数)。
 

　　在接种疫苗2周后，产生的抗体亲和力随着接种时间增加而增加，4周的时候KD值为362pM,8周的时候为6pM。相比之下，使用未修饰的mRNA或灭活的流感病毒颗粒免疫的小鼠中抗体的亲和力低得多。Tfh细胞反应通过体细胞超突变驱动亲和力成熟；但是需要进一步对Ig可变基因进行测序，并检测纯化的单克隆抗体的亲和力。
 

　　图4. Octet® 测试结果发现：mRNA疫苗免疫时间越长，抗体亲和力越高；纵坐标为KD值(单位nM)
 

　　图5. 相对于未修饰的mRNA疫苗(中)和灭活疫苗(右)，修饰的mRNA疫苗(左)的亲和力最高
 

　　高亲和力抗体的产生是中和多种病原体的基础。这项研究证明了m1Ψ-mRNA-LNP疫苗能够产生针对流感病毒、ZIKV和HIV-1的高滴度、高亲和力和持续性中和抗体的能力。
 

　　辉瑞和BioNtech的 mRNA疫苗（BNT162b2）
 

　　卡里科博士作为BioNTech公司的高级副总裁，在新冠爆发后，带动了新冠mRNA疫苗的问世。
 

　　它是头一个大规模使用的新冠mRNA疫苗。在其递交给欧洲药物管理局(EMA)的评估报告^[2]和发表的Nature研究性文章^[3]中均提到：
 

　　利用Octet® 非标记分子互作系统(BLI技术)来测定mRNA表达产物的结合活性。通过生物传感器分别固化ACE2和抗体，与293T细胞中表达的不同浓度的S蛋白(疫苗表达产物)进行亲和力测定。两者的亲和力均在nM级别，符合正常S蛋白与受体及中和抗体的结合能力，并以此作为疫苗功能确认的指标之一。
 

　　在其公布临床前研究中可发现，该疫苗编码的是S蛋白，其中986/987位氨基酸残基突变成了脯氨酸，与野生型S蛋白相比，不会与细胞膜融合，维持了融合前构象。该疫苗的表达产物保持了与受体ACE2以及一种RBD中和抗体的亲和力。同时，还同时设计了其他序列，一起与BNT162b2平行比较，最终选择了BNT162b2作为候选mRNA疫苗。
 

　　我们都知道，从分子生物学的角度来看，RNA是一种非常不稳定的分子。然而，通过几十年的技术积累，科学家们成功的将RNA做成一类疫苗，并在新冠疫情种拯救了数以千万计的生命。这也就是为什么这次诺贝尔医学奖众望所归的原因吧。
 

 

　　使用Octet® 非标记分子互作系统的优势？
 

　　· 非标记Direct Binding是趋势，它的亲和力测试结果更准确

　　· 快速测定亲和力，更加定量化对互作进行表征

　　· 无洗涤步骤，可测弱亲和力(解离快) 

　　· 测试时间短，一般10-20分钟，更快拿到结果 

　　· 实验形式多样化：定性，两者结合，协同/竞争实验，垂钓 

　　· 写入了美国药典，文章多于13,000篇，认可度广 

　　· 万金油技术，可以用于检测DNA、小分子、蛋白等各种生物分子 

　　· 使用方便，成本相对低，对粗样品耐受性好；比如本文就直接检测小鼠血清抗体

　　· 通量大；本文就用Octet® 检测了十几个小鼠样本(多浓度)

       -参考文献-

         [1] Nucleoside-modified mRNA vaccines induce potent Tfollicular helper and germinal center B cell responses. J. Exp. Med. 2018 Vol. 215 No. 6 1571–1588
         [2] Procedure No. EMEA/H/C/005735/0000.
         [3] Vogel AB, Kanevsky I, Che Y, Swanson KA, Muik A, Vormehr M, Kranz LM, Walzer KC, Hein S, Güler A, Loschko J, Maddur MS, Ota-Setlik A, Tompkins K, Cole J, Lui BG, Ziegenhals T, Plaschke A, Eisel D, Dany SC, Fesser S, Erbar S, Bates F, Schneider D, Jesionek B, Sänger B, Wallisch AK, Feuchter Y, Junginger H, Krumm SA, Heinen AP, Adams-Quack P, Schlereth J, Schille S, Kröner C, de la Caridad Güimil Garcia R, Hiller T, Fischer L, Sellers RS, Choudhary S, Gonzalez O, Vascotto F, Gutman MR, Fontenot JA, Hall-Ursone S, Brasky K, Griffor MC, Han S, Su AAH, Lees JA, Nedoma NL, Mashalidis EH, Sahasrabudhe PV, Tan CY, Pavliakova D, Singh G, Fontes-Garfias C, Pride M, Scully IL, Ciolino T, Obregon J, Gazi M, Carrion R Jr, Alfson KJ, Kalina WV, Kaushal D, Shi PY, Klamp T, Rosenbaum C, Kuhn AN, Türeci Ö, Dormitzer PR, Jansen KU, Sahin U. BNT162b vaccines protect rhesus macaques from SARS-CoV-2. Nature. 2021 Apr;592(7853):283-289. doi: 10.1038/s41586-021-03275-y. Epub 2021 Feb 1. PMID: 33524990.